Miroslava Rysová se v Oddělení aplikované biologie Ústavu pro nanomateriály, pokročilé technologie a inovace Technické univerzity v Liberci ve svém výzkumu již deset let zaměřuje na nanovlákna. Konkrétně na to, jak v medicíně využít v kožním lékařství specifické vlastnosti nanovlákenných materiálů, ale také jak využít další materiály, třeba ve formě tenkých vrstev a biodegradabilních nanočástic, k funkcionalizaci nanovlákenných struktur. Na toto aktuální téma jsme jí položili několik otázek.
Vaší doménou je využití nanovlákenných materiálů v regenerativní medicíně?
Ústav pro nanomateriály, pokročilé technologie a inovace je jako celek zaměřený především na aplikační výzkum. Doménou našeho týmu jsou především nanovlákenné systémy pro dopravu léčiv a regenerativní medicínu, hlavně pro použití při hojení chronických a nekrofilních ran. Pracujeme nejen se strukturou nanovláken, kterou se snažíme různě modifikovat a upravovat, ale i s jejich materiálovým složením, které přidává další jedinečné vlastnosti.
Nanovlákenné kryty ran mají vynikající vlastnosti, které přirozeně stimulují hojení ran a umožňují jejich využití i jako nosičů léčiv a aktivních molekul. Zajímavé jsou z vědeckého hlediska možnosti kombinací těchto vlastností při hojení kožních poranění. To probíhá v několika fázích, které ovlivňuje zvolený materiál a léčivo zvolené pro vazbu nebo včlenění (inkorporaci) do nanovlákenné struktury. U každého léčiva je potřeba inkorporovat jinou optimální dávku a dosáhnout jiného profilu kinetiky uvolňování.
S jakými materiály pracujete?
Neděláme polymerní syntézu, ale vzájemně kombinujeme a různě funkcionalizujeme zejména syntetické, ale i přírodní polymery. Pracujeme s celou škálou nanovláken využitelných pro hojení ran.
Každý materiál má odlišné vlastnosti, a je tedy vhodnější pro jinou fázi hojení. Zabýváme se materiály pro kontaminované rány i dopravou a uvolňováním léčiv v jejich prostředí. Nehledáme přímo nové aplikace, ale řešíme problém v dané aplikaci a k tomu designujeme vhodný materiál.
Z přírodních polymerů pracujeme například s nanovlákny želatiny, kolagenu, chitosanu nebo hedvábného fibroinu (silk fibroin — SF), což je protein získaný z kokonů bource morušového. Pracujeme také s anorganickými nanomateriály, třeba na bázi oxidu křemičitého.
Kde tyto materiály získáváte a jak je zpracováváte?
Chitosan je polymer získaný deacetylací chininu a tvoří základní stavební složku schránek korýšů a hub. Jde o vedlejší produkt rybárenského průmyslu a vlastně o odpad. Kupujeme ho a v laboratoři sami zvlákňujeme. Na trhu je této suroviny obrovské množství, my však pro naše účely vybíráme jen zboží vysoké medicínské kvality a čistoty. Musí se počítat s tím, že to je přírodní nesyntetizovaný materiál, což znamená určitou variabilita kvality mezi jednotlivými šaržemi, kdy se u přírodních organismů promítají i klimatické podmínky.
Pracujeme také s polymerními nanovlákny. V medicínských aplikacích nanovláken je například hodně využívaný a na trhu dostupný polykaprolakton. Výhodou tohoto syntetického polyesteru je, že je zvláknitelný širokou škálou rozpouštědel, což umožňuje dosažení různé morfologie vláken, preferované pro konkrétní účely. Požadavky na strukturu nanovláken se totiž mohou v různých oblastech, např. v hojení ran a ve tkáňovém inženýrství, značně lišit. A to i s ohledem na typ tkáně. Protože každá tkáň a každý buněčný typ preferuje jinou strukturu a jiné materiálové složení.
Možnost zvlákňování z tak širokého spektra rozpouštědel pak umožňuje kombinace s dalšími materiály, jako jsou různá léčiva a biopolymery, v závislosti na jejich rozpustnosti a kompatibilitě. Tím se zlepšuje jeho bioaktivita a zvyšuje se i stimulace růstu buněk. Tyto kombinace připravujeme elektrostatickým zvlákňováním nejprve laboratorně a potom, v případě, že se osvědčí, na poloprovozním zařízení Nanospider. To je zvlákňovací zařízení, vyrobené na základě patentu týmu profesora Oldřicha Jirsáka podaného na Technické univerzitě v Liberci.
Pracujeme i na nových materiálech, o kterých zatím nelze veřejně mluvit.
Jaké materiály preferujete: přírodní, nebo syntetické?
Mezi výhody syntetických polymerů patří stabilní kvalita a většinou dobré mechanické vlastnosti produktu. Řada syntetických polymerů je nedegradabilní, což představuje problém z ekologického hlediska. My ale většinou pracujeme se syntetickými polymery, jejichž doba rozkladu při fyziologických podmínkách se pohybuje v rozmezí od půl do jednoho roku.
V případě přírodních polymerů, jako je chitosan nebo silk fibroin, je rozklad mnohonásobně rychlejší, takže je nutná jejich stabilizace (tzv. síťování), aby došlo k jeho zpomalení. Přidanou hodnotou přírodních polymerů je jejich vyšší bioaktivita, a právě proto se hodně zabýváme kombinací obou typů, abychom získali z obou materiálů to nejlepší.
Jaký je současný trend vašeho výzkumu?
V současné době je jedním z hlavních směrů výzkumu dekontaminace ran a s tím související využívání antibakteriálně aktivních proteinů a přírodních látek. Důvodem je všeobecně se zvyšující bakteriální rezistence vůči antibiotikům. Dalším důvodem jsou změny v doporučeních lékových agentur souvisejících s vývojem rezistence.
Pokud je zaznamenán rozvoj rezistence vůči konkrétnímu antibiotiku nebo jeho skupině, je na delší období doporučeno snížení nebo zastavení jeho používání. To se stalo před nějakou dobou například u tetracyklinu. Z tohoto důvodu pracujeme s několika různými typy širokospektrálních antibiotik a snažíme se dosáhnout co největší robustnosti našich nanovlákenných krytů, aby nás takový vývoj nezaskočil a nevrátil o několik let zpátky.
I proto existuje snaha zkoumat využití jiných než antibiotických antibakteriálně účinných látek a jejich kombinací pro dosažení synergického efektu pro dlouhodobější ochranu.
O jaké látky se jedná?
Zabýváme se využitím antibakteriálních iontů, například stříbra a zinku. Biogenní ionty, stejně jako jiné molekuly, mohou pomoci při hojení ran. Je to jeden z typů aktivních látek, které zabudováváme do nanovláken, jednak kvůli jejich antibakteriálnímu účinku, ale také schopnosti modifikovat zánětlivou odpověď v ráně, která nastartuje proces hojení známý jako reepitalizace.
Problém u špatně se hojících a chronických ran je většinou v tom, že dojde k zacyklení v zánětlivé fázi. To může být způsobeno chronickým onemocněním pacienta, nebo kontaminací. U kontaminace rány jsme schopni řešit primární příčinu. V případě chronického onemocnění, jako je diabetes, bohužel ne, ale snažíme se připravit nanovlákna, vhodná pro podpůrnou léčbu k celostní terapii pacienta.
Je celá řada prvků a dalších látek, které mají antibakteriální vlastnosti a dají se využít v dekontaminaci ran. Tím nejznámějším příkladem je stříbro, ale i u dalších prvků, jako je například měď, byly potvrzeny protizánětlivé, proangiogenní a další účinky. Důležité je vědět, že efekt je vždy dán nejen formou, ale také dávkou.
Zkoumáme například i využití antibakteriálně účinných peptidů a proteinů. Ty mohou pocházet z různých zdrojů bakteriální produkce nebo třeba od včel, jako například melittin, a bohatým zdrojem medicínsky zajímavých proteinů jsou také houby. Poslední dobou vědci věnují pozornost FIP proteinům (fungal immunomodulatory proteins — houbové imunomodulační proteiny) a jejich širokým mechanismům účinků. Ty, zjednodušeně řečeno, pomáhají regulovat mezibuněčné interakce, výsledkem čehož je aktivace imunitních buněk a následně protialergické, protizánětlivé a protinádorové účinky. Tyto typy látek a jejich kombinace jsou pro nás z hlediska dalšího výzkumu velmi zajímavé a je to něco, na co bychom se rádi podívali v následujících letech.
Výzkumných témat teď máme více a je jen otázkou, kdy se k intenzivnímu výzkumu dostaneme. Výzkum je totiž velmi náročný na čas a prostředky, a proto hledáme projektové partnery, které naše témata a předběžné výsledky v dané oblasti zaujmou a budou s námi chtít pokračovat ve výzkumu. Musíme nabídnout něco, co bude mít reálný přínos v dohledné době, to znamená vyrobitelný a funkční materiál, a proto u připravených nanomateriálů pečlivě ověřujeme jejich strukturu a biokompatibilitu.
Zajímá mě váš výzkumu imobilizace enzymů…
To má pro medicínu velký význam, protože enzymy jsou v podstatě biologické katalyzátory, které je možné využívat k podpoře různých jevů při čištění ran. Tam se používají například proteolytické enzymy, které štěpí a degradují proteiny.
My se zabýváme imobilizací enzymů, protože imobilizované enzymy lze využít například i v senzorice, v analýze biologických dějů i v rámci čištění vod. Podařilo se nám imobilizovat již několik druhů enzymů pro různé aplikace. Spadá do nich i trypsin a proteáza, kterou jsme imobilizovali konkrétně pro čištění nekrotických ran.
Výhodou imobilizovaných enzymů je jejich stabilita při ukotvení na povrch nanomateriálu. Ta vazba je ideálně pevná a zároveň nenarušuje katalytickou aktivitu imobilizovaného enzymu. Imobilizace je výhodná, a navíc prodlužuje aktivitu enzymu, který se pak nevyplavuje a zůstává vázaný na potřebném místě. Je tak možné u nekrotizujících ran vyčistit i drobná ložiska, která jsou zdrojem permanentního zánětu a odumírání okolní tkáně, a tím se zvyšuje šance, že se nastartuje přirozený hojicí proces.
Rozměr těchto ložisek, která zůstávají po chirurgickém debridementu, je tak malý, že je často nelze identifikovat pouhým pohledem. Právě v takovém případě se aplikují enzymy, které jsou schopné tkáň čistit na molekulární úrovni, a ten proces se musí několikrát opakovat, aby došlo ke spolehlivému vyčištění rány. Právě v tom vidíme přínos nanovláken s konjugovanými enzymy.
Ukazuje se, že když je nanovlákenný nosný systém dostatečně silný s dobře vázaným enzymem, mělo by být možné aplikovat menší množství enzymu, a prodloužit tak jeho účinnost, a tím vlastně zvětšit intervaly mezi jednotlivými aplikacemi na ránu. Tuto enzymatickou účinnost zkoumáme a testujeme v laboratoři. Zkoumáme třeba závislost mezi metodou vazby, typem enzymu a složením nanovlákenného nosiče a na základě průběžných výsledků systém optimalizujeme. Je to vlastně cyklus, kdy ten materiál neustále upravujeme. Ale samozřejmě dokud se nebudou dělat preklinické testy, tak si nebudeme stoprocentně jisti, jaké konkrétní úpravy jsou optimální.
Jak na váš výzkum nahlíží lékařská obec?
Pro náš výzkum jsou podněty od lékařů velmi důležité a jsme rádi, že máme k dispozici názory lékařů z Krajské nemocnice v Liberci, ale i z jiných lékařských zařízení. Od klinických zkoušek jsme ještě dost daleko, ale je pro nás velmi důležité vědět, že je poptávka po nových materiálech, vědět, jaký problém lékaři reálně řeší a jaká konkrétní léčiva či jejich kombinace momentálně používají pro hojení ran.
Získáme od nich také odezvu, jaká je šance výsledky našeho výzkumu aplikovat. Sebelepší, ale obtížně aplikovatelný nebo příliš drahý či špatně skladovatelný materiál, se kterým by se lékařům špatně pracovalo, by šanci na uvedení do praxe neměl, a bylo by plýtvání časem se mu hlouběji věnovat. Ta zpětná vazba je pro nás velmi důležitá.
Samozřejmě, názory jednotlivých lékařů se mohou i lišit, ale pokud se většina shodne, že to je dobrý nápad a že by něco takového potřebovali, pak my do toho jdeme a pokoušíme se jim něco nabídnout.
Takové podněty od lékařů dostáváme a týkají se většinou pro lékařskou praxi zajímavých léčiv. Může se například jednat o to, že potřebují, aby aktivita materiálů byla delší než 24 hodin, nebo aby se daný materiál mohl skladovat delší dobu. Skladovatelnost a dobu účinnosti jsme řešili třeba u nanovláken s konjugovanými enzymy. Samozřejmě se může stát, že se nám dané vlastnosti nepodaří optimalizovat tak, jak bychom my a lékaři chtěli. Vždy musíme počítat s omezením materiálů i technologií.
V poslední době se bohužel kvůli pandemii komunikační kanály oslabily, protože síly lékařů i zdravotnického personálu se pochopitelně napnuly úplně jiným směrem, než je výzkum. Máte komu výsledky svého výzkumu nabídnout? V našem výzkumu jsme hodně závislí na spolupráci s partnery a také tady se na výzkumu negativně podepsala pandemie. A to jak z hlediska našich kapacit, tak i z hlediska spolupráce s firmami. Řada firem, které se zabývají aplikacemi a vývojem nanomateriálů, logicky z velké části převedla výrobu na roušky.
Jsme ale v úzkém kontaktu například s libereckou firmou Nanomedical, která se o výzkum v této oblasti velmi aktivně zajímá, a máme s ní do roku 2024 dokonce společný projekt zaměřený na vývoj optimalizace chitosonových nanovláken a využití jejich výjimečných vlastností pro hojení ran.
Obecně pro nanovlákna platí, že mají vysoký měrný povrch, vysokou pórovitost a zároveň malý rozměr póru. To jsou vlastnosti, které specificky ovlivňují prostředí kožní rány. Aby se rána dobře hojila, musí docházet k výměně plynů mezi ranou a vnějším prostředím, kterou zajistí právě ta vysoká pórovitost. Aby bylo zachováno vlhké prostředí a rána nevysychala, jsou potřebné další materiálové podněty, které jsou chitosonová nanovlákna schopna poskytnout, protože mají tendenci se ve vlhkém prostředí měnit na hydrogel, tedy gel s vysokým podílem vody.
Další výhodou těchto vláken pro léčení kontaminovaných ran jsou jejich přirozené antibakteriální vlastnosti a jejich bioaktivita podporující hojení. Je to proces, kdy se molekuly chitosanu z nanovláken uvolňují a poskytují živiny pro buňky proliferující v kožní ráně. [Proliferace je množení, bujení, novotvoření, například skupiny buněk — pozn. red.]
Takže se v brzké době dočkáme aplikace v praxi?
Bude to ještě nějakou chvíli trvat. Aby jakékoliv materiály došly do praxe, musí projít dlouhým, náročným a drahým schvalovacím procesem. Nikdo si nedovolí aplikovat na pacienta něco, co není schválené a dostatečně prověřené. S lékaři spolupracujeme v oblasti základního výzkumu, ale ještě žádný námi zkoumaný materiál není ve fázi klinických zkoušek. K tomu je většinou třeba, aby se zapojil komerční partner, který je ochotný při vědomí si všech rizik investovat miliony do klinických studií.
Už jsme s českými partnery úspěšně dokončili výzkumné projekty zaměřené na vývoj materiálů pro hojení ran, k docílení prodlouženého uvolňování antibiotik do rány a také na vývoj nanovláken s biokatalytickou aktivitou pro čištění nekrotických ran a popálenin. Projekty jsme dokončili v roce 2020, na společné výsledky jsme podali patenty a užitné vzory a nyní zbývá jen čekat, jestli se ty produkty dostanou na trh. Komercializace je totiž velmi náročná a záleží na firmách, zda ji dotáhnou do konce.
Upřímnou radost mám z toho, že jsme vyvinuli nový nanomateriál pro hojení ran a podali jsme mezinárodní patent. O tom ale samozřejmě mluvit nemůžu, dokud nám nebude udělen. Musí se udělat rešeršní průzkum, což může to trvat rok i dva, a stejně nemáme jistotu, že ho získáme. Výzkumu v oblasti nanomateriálů a zejména nanovláken pro hojení ran se intenzivně věnuje řada výzkumných pracovišť. Můžeme mít smůlu v tom, že nás někdo předběhl.
Takže intenzivně zkoumáte s výsledkem nejistým. A máte radost z něčeho, o čem mluvit můžete?
Mám radost z podaných a dokončených projektů i z podaných patentů, i když o nich ještě mluvit nemohu.
Že to neděláme úplně špatně, dokazuje i to, že o materiály, které vyvíjíme, mají zájem v zahraničí a že se nám daří rozvíjet mezinárodní spolupráci s řadou výzkumných pracovišť. Máme partnery v Německu, s irským partnerem na RCSI v Dublinu teď podáváme společný projekt. V mezinárodních projektech je šance získat silného partnera, ať je to univerzita, výzkumný ústav, nebo firma, která je ochotná do výzkumu investovat.
Třeba Irsko, to je biotechnologická velmoc v Evropě, protože dokázalo přilákat významné biotechnologické a medicínské giganty, a my si od spolupráce s Irskem hodně slibujeme. Mezinárodní výměna názorů a zkušeností přináší užitečnou zpětnou vazbu i cenné poznatky z analýz, které my neprovádíme, a možnost pracovat ve špičkově zařízených laboratořích.
Jak jste v Liberci na tento náročný výzkum vybaveni?
Poměrně dobře. Jsme zařízeni na testy in vitro (na skle) — tedy vlastně na základní fázi biologického testování materiálu, kde ověřujeme jeho biokompatibilitou, abychom věděli, zda ho můžeme posunout dál. Naše sterilní laboratoř pro buněčné kultivace je vybavena boxy s laminárním prouděním pro práci s buňkami a inkubátory pro jejich kultivaci. Máme klasické zařízení a vybavení pro analýzy, jako je fluorescenční mikroskopie, optická mikroskopie, elektronová mikroskopie, ale i poměrně unikátní zařízení xCelligence [mikroelektronický biosenzorový systém pro buněčné testy, který poskytuje dynamickou buněčnou analýzu v reálném čase — pozn. red.]. To nám pomáhá hledat časový interval pro detailnější analýzy v závislosti na platných normách.
Normované testy jsou většinou nastaveny tak, aby se v krátkodobém režimu prováděly po 24 hodinách expozice materiálu. Tak se testuje například akutní toxicita. Někdy ale toxický efekt nastává až po 48 nebo 72 hodinách nebo i později, a to zkoumáme v návaznosti třeba na koncentraci nanomateriálu nebo léčiva. Provádíme také degradační testy v simulovaných podmínkách, testujeme kinetiku uvolňování léčiv i jejich antibakteriální účinnost.
Naše oddělení disponuje akreditovanou mikrobiologickou laboratoří. Můžeme provádět i PCR analýzu, která ukazuje přítomnost různých virových a bakteriálních infekcí. To jsou testy prováděné v laboratoři a na oddělení. Na další fázi, in vivo (v živém), ale vybaveni nejsme.
Často se hovoří také o rizikách nanomateriálů.
Obava z toxicity nanomateriálů je racionální. Je dobře, že se řeší, i když s určitým zpožděním. Mám na mysli situaci, která nastala před lety, kdy se na trh uváděla celá řada produktů s nanočásticemi a někdy chyběla dostatečná kontrola bezpečnosti. Až později se začalo řešit, jestli ty částice nejsou uvolňovány do životního prostředí nebo například neovlivňují kvalitu pitné vody.
Příkladem jsou nano- a mikroplasty, i když vznikají jako sekundární produkt užívání plastových výrobků. U primárních nanočástic teď naštěstí platí, že především ty určené pro využití v kosmetice a medicíně podléhají přísné kontrole.
Samozřejmě že i nanovlákenné materiály mohou mít svá rizika a nevýhody. My je nepodceňujeme a ve svém výzkumu se jimi zabýváme. U všech nanomateriálů, které u nás vyvíjíme nebo upravujeme, testujeme jejich biokompatibilitu, antibakteriální účinnost, biodegradaci a případně i interakce s krevní plazmou, kdy dochází k adsorpci proteinů na jejich povrch.
Biokompatibilita je základní podmínkou aplikace všech nanomateriálů v medicíně. Jedná se o snášenlivost materiálu v biologickém prostředí a testuje se různými metodami a na různých úrovních.
Provádíme i testy antibakteriální aktivity, kdy naopak chceme, aby materiál byl pro bakteriální buňky toxický nebo alespoň inhiboval jejich růst. V medicíně jsou pravidla pro uvádění nových materiálů na trh velmi přísná. Věřím, že to výzkumné pracovníky i firmy nutí k tomu, aby do praxe uváděly materiály dobře otestované a bezpečné.